### 产品及特点

本产品是基于探针法荧光定量PCR原理开发的检测试剂盒，具有以下特点：
1. 即开即用，用户仅需提供样品DNA模板。
2. 引物及其他组分经过优化，灵敏度极高。
3. 提供阳性对照，方便区分假阴性样品。
4. 高特异性，引物设计基于中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区域，确保不与其他生物样本DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，也支持定量检测，定量检测时线性范围至少涵盖5个数量级。
6. 本产品可支持50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7. 本产品仅供科研使用。

### 方法步骤

一、DNA提取（样本制备区）
使用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒与市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

二、稀释标准曲线样品（样本制备区）
（由于阳性对照浓度较高，请在独立区域进行以下稀释操作，以避免污染样品或本试剂盒的其他成分。）
1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入45μL DEPC-H₂O。
3. 在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，以得到1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
4. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得到1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
5. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，以得到1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
6. 重复上述操作，直至获得6个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释至1×10E5拷贝/μL即可。

三、试剂配制（试剂准备区）
若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管（N个待检样品+1个阴性对照+6个阳性对照），向各PCR管中分别加入所需成分（详见说明书，欢迎向尊龙凯时索取）。

四、添加模板（模板添加区）
向qPCR管中加入2μL模板，添加顺序为阴性对照（DEPC-H₂O）、待测样品模板及婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。

五、扩增反应（扩增及产物分析区）
将PCR管放置于PCR扩增仪器的样品槽中，进行扩增，扩增程序详见说明书（可向尊龙凯时索取）。

六、结果分析
1. 若制作标准曲线，以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴绘制标准曲线；通过待测样品的Ct值推算出样品DNA浓度的log值，从而计算其浓度。
2. 若未制作标准曲线，依据以下标准判定结果：阳性对照结果：Ct值<30，呈现明显指数增长和典型S型曲线；阴性对照结果：Ct值38或无Ct值，无明显指数增长及平台期；样本检测结果：Ct值<35，明显指数增长，表明样本中检测到婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct值38或无Ct值，表明样本中未检测出婴儿利什曼虫，结果为阴性；Ct值在35-38之间则需复检，如重复实验结果仍在35-38范围且有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

### 运输及保存
请低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂。